內容

介紹

21世紀初在我們的各種生物,最顯著的例子是人類基因組測序的DNA序列的認識經曆了一場革命。基因組DNA的分析使我們了解進化了很多,而DNA序列中隱藏的語言不同生物之間的關系,由基因控制的機制,對疾病的易感性。整個基因組的測序是尚未然而,常規技術中,和遺傳分析的其它方法用于快速和有效地分析DNA樣本。這些方法和技术,如DNA指紋图谱,也改变法医学。

DNA測序,基因和取证分析所有的已建立的方法依赖于使用标记的寡核苷酸和/或脱氧或双脱氧三磷酸核苷,和需要的DNA聚合步骤。這可以是聚合酶鏈反應(在遺傳分析STR分析),單核苷酸延伸(微型測序SNP分析),或聚合和DNA鏈終止(的組合Sanger測序)。

聚合酶鏈反應(PCR)

聚合酶鏈反應(PCR)是在分子生物学,诊断学,法医学和分子遗传学广泛使用,以扩增一个特定区域(一个技术擴增子的DNA樣品的)。PCR可以放大珍贵的DNA样本(如在犯罪现场)的几个分子产生大量的DNA,从50到长度超过25 000个碱基对。

在PCR中,两个短寡核苷酸(PCR引物)的设计,使得每个互补于在该区域的两个靶链之一的3'-端待扩增:两个PCR引物限定的擴增子。由引物結合模板的區域中的一系列的循環(擴增圖1)。PCR需要的DNA聚合酶。而所有生物體含有DNA聚合酶,即在PCR中使用的聚合酶來自嗜熱菌棲熱菌屬aquaticusTaq聚合酶是耐热的,這意味着高达95℃的温度下可在PCR中使用,低的条件DNA雙鏈體的穩定性

聚合酶鏈反應(PCR)

圖1 | 的聚合酶鏈反應(PCR)

在第一周期中,雙鏈靶被分離成通過加熱兩個單模板鏈至95℃。然後將其冷卻至55℃,以允許合成的寡核苷酸引物退火到模板鏈與它們的3'端彼此相對。然后将温度升高到72℃,对于热稳定的Taq DNA聚合酶的活性最适温度。聚合酶使用脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs濃度),以引物沿著生産的DNA兩個新的雙鏈(模板的長度延伸。圖2)。

PCR循環

圖2 | PCR循環的聚合酶鏈式反應的單個周期。

PCR的第二周期是第一周期的重複,並且每個新合成的單鏈也可以作爲引物退火和延伸的模板。聚合酶只能盡可能延長DNA作爲第一引物的位點,産生特定長度的DNA雙鏈體。在所有的后续周期的扩增产生的PCR产物由两个引物的位点特定的长度,而這些PCR产物很快多于原本的目标分子。在理論上,Ñ的PCR循環将产生2 Ñ PCR産物。

由凯利·穆利斯20世纪80年代发明的,聚合酶链反应已是穆利斯被授予了分子生物学,DNA诊断和法医学這样一个无处不在的影响諾貝爾獎

引物二聚體的形成

不正确的擴增子在PCR中有时产生由于引物二聚體形成,其中,所述PCR引物杂交,和被放大的代替模板DNA(圖3)。引物二聚體是最有可能以在PCR擴增開始時,當引物中存在的高濃度相對于模板。引物二聚體formatin可發生即使有幾個錯配的引物-二聚體雙鏈體,其由結合于Taq聚合酶穩定。引物二聚體的形成是当几个PCR反应在同一个管(多重PCR)进行了一个特别的问题。

引物二聚體的形成

圖3 | 引物二聚體形成的,而不是DNA模板擴增的形成與引物二聚體的擴增,可以對PCR産生不利影響。

在减少引物二聚體形成明显的步骤是,使它们具有低的自身互补来设计引物,但是這并不总是可能的,并且可能会导致引物二聚体的扩增甚至弱相互作用。“热启动”PCR技术已经发展到减轻引物二聚體的形成。在熱啓動PCR反應混合物最初缺少的重要組成部分,如Taq聚合酶,或Mg 2+(其中Taq聚合酶需要活性)。在第一周期開始長時間加熱確保了所有的引物二聚體的變性,則該缺失的組件添加。PCR現在可以繼續正常。該技術的主要缺點是汙染的加入必須成分的,以打開反應管中的可能性。一個替代方法包括,關于加熱解離的使用Taq聚合酶的非共價抑制劑(例如肽或抗體)。在另一方法中,PCR反应的一个重要组成部分是封闭在一个蜡丸,熔化在加热时,释放其內容。

DNA測序

所有這一切,因为在30年前由弗雷德·桑格在剑桥制定的方法是不可能的。桑格制定了关于他被授予他的第二个DNA測序(双脱氧法)的新方法諾貝爾文學獎,1980年。

桑格(双脱氧)DNA測序

桑格的DNA測序的双脱氧方法是常规地用于在实验室中的DNA測序的第一个方法。以下组件所需的Sanger測序:

  • DNA模板進行測序
  • 在5'端標記的與寡核苷酸引物32 P
  • DNA測序聚合酶
  • 四脫氧核苷三磷酸:的dATP,dGTP,的dCTP,dTTP的
  • 四脫氧三磷酸核苷(缺少2'-和3'-羟基的三磷酸核苷):的ddATP,的ddGTP,ddCTP的,ddTTP(圖4

桑格測序是一個修改形式的DNA複制引物雜交到模板的特定位點與聚合酶結合,並結合核苷酸組裝模板的反向互補拷貝。這一过程将不提供在模板上的序列和用于此目的4测序反应在分开的试管中进行的任何信息。在每個管中的關鍵成分的少量,2',3'-二脫氧核苷三磷酸的溶液。雙脫氧三磷酸核苷的ddATP加入到管1,的ddGTP至管2的ddCTP至管3和ddTTP到管4。

雙脫氧核苷酸triphosphoates的結構(的ddNTPs)

圖4 | 雙脫氧核苷酸triphosphoates的結構(的ddNTPs)

該聚合酶不三磷酸脫氧核苷(dNTPs濃度)和雙脫氧核苷三磷酸(的ddNTPs)區分,所以要麽可以在每個步驟中添加。如果添加dNTP的是,DNA鏈將繼續增長; 如果加入的ddNTP,則該DNA鏈將終止,因爲它沒有3'-羟基基團,以與傳入核苷三磷酸的反應:沒有進一步的核苷可以增加。在每個管的結果是不同長度的寡核苷酸,都端接一個特定的ddNTP的混合物在管1的所有終端將在A,在管2在G,在管3中C,並在管4在T該寡聚物可然後根據其大小通過電泳進行分離。如果所有四個梯子上的聚丙烯酰胺凝膠上並排,並且凝膠暴露于照相膠片,所述32 P標記的片段將産生可用于讀取DNA序列(其將是反向的圖像模板的補體)(圖5)。在實踐中有可能通過該方法測序周圍的DNA的300個堿基。

桑格(雙脫氧)測序

圖5 | 桑格(雙脫氧)測序

基于荧光二脱氧DNA測序

在Sanger測序的自动化高通量荧光版本,未标记的寡核苷酸引物使用,具有耐热性DNA聚合酶,四正常的脱氧核苷三磷酸,和具有四个双脱氧三磷酸核苷沿不同的熒光標記上它們(圖6)。

現在只有1測序反應是必要的,因爲終止在的ddA使DNA片段的特定原子熒光顔色,子ddG不同的顔色,DDC第三顔色和DDT的第四顔色。所述熒光染料的性質取決于所使用的DNA序列,但基本要求爲四染料具有良好分辨熒光發射光譜。一個常見的系統采用FAM,JOE,TAMRA和ROX四大染料(見表1)。

表1 ? 基于fluorescece測序中使用熒光染料; 它們的吸收(激發)和發射和顔色的波長

染料 最大。吸收波长/ nm的 最大。发射波长/ nm的 顔色
FAM 495 520 藍色
JOE 530 555 綠色
TAMRA 550 575 黃色
ROX 580 605

的片段通過電泳分離和熒光染料由激光激發。凝膠圖像然後可以由計算機進行分析和DNA序列産生。超過800個堿基可以在一個單一的凝膠泳道中讀出。DNA自动测序仪可以分析在单一凝胶(从一个凝胶76 800即约基地)96个不同车道,可以分析3凝胶,每天给人每天大约有230 400个碱基或每年超过50 000 000基地的吞吐量。機已經發展到同時分析384測序反應。其他最近的創新包括標有兩個熒光染料(“大染料化學”),雙脫氧三磷酸核苷的發展。一種染料(通常熒光素)在其λ的激發最大值在520nm處495處的結果中發射其通過FRET轉移到具有λ第二染料最大值接近520納米。第二染料在較高波長強烈熒光。這将产生比通过第二荧光染料的直接激发在495nm处可以得到更强的荧光信号。的進步也已經在凝膠技術制成。利用毛細管凝膠,而不是平板凝膠促進了樣和分析的自動化,提供更高的吞吐量。

荧光桑格(雙脫氧)測序

圖6 | 荧光桑格(雙脫氧)測序

新一代測序

人类基因组计划完成了人类基因组的3比永碱基对的测序完成,在1990年和2003年之间的巨大协同努力的人类基因组计划依靠的结果(尽管高优化和自动)Sanger測序。现在可以在几天之内,以序列的整个人类基因组,由于采用了新一代统称为下一代DNA測序测序技术的。

測序修飾的DNA

现有的DNA測序方法(包括下一代测序)是不能检测修饰的碱基。與在感興趣的最近激增表觀遺傳學,未能胞嘧啶和5-甲基(這两个构成沃森-克里克碱基对与鸟嘌呤)区分是当前的测序技术的一个严重的缺点。

亞硫酸鹽測序

亞硫酸氫鹽(HSO 脫氨非甲基化胞嘧啶向尿嘧啶,但不與甲基胞嘧啶(反應圖7)。這提供了含有5-甲基胞嘧啶碱基测序的DNA的方法。前和亞硫酸氫鹽處理後的DNA進行測序:從胞嘧啶到尿嘧啶任何變化被歸因于非甲基化胞嘧啶,而被假定保持亞硫酸氫鹽處理後的胞嘧啶堿基的原始樣品中的被甲基化。

胞嘧啶重亚硫酸盐转化成尿嘧啶

圖7 | 胞嘧啶重亞硫酸鹽轉化爲尿嘧啶亞硫酸氫鹽(HSO 非甲基化胞嘧啶轉換爲尿嘧啶,但不轉換甲基胞嘧啶到胸腺嘧啶。

亞硫酸鹽測序

圖8 | 亞硫酸氫鹽測序的DNA測序用亚硫酸氢盐处理之前和之后(HSO ),该脫氨非甲基化胞嘧啶碱基为尿嘧啶,允许确定DNA样品的甲基化状态。

市售重亚硫酸盐转化试剂盒使该过程例程,但它仍然是昂贵的:必须注意,所有未甲基化的胞嘧啶脫氨,并且每个DNA样品必须(当然)进行测序两次。

DNA指紋图谱

DNA指紋图谱是在上世纪80年代在英国莱斯特大学发明了亚历克·杰弗里斯爵士。人DNA可通過該方法來分析在基因水平肯定比以前的法醫方法如血型判定或傳統指紋分析的遠較大程度來識別個人。DNA指紋(也称为DNA分析,DNA分型或基因指纹)也可用于确定个体之间的关系(例如親子鑒定)。

DNA指紋图谱迅速成为英国国家DNA数据库,其中包含数以百万计的个人档案的技术基础。現在是在檢測和罪犯定罪經常使用的主要資源,並産生數百每星期在犯罪現場發現的DNA匹配。短串聯重複序列的分析序列(STR)形成在世界各地使用法医DNA分析系统的基础。

短串聯重複序列

兩個隨機選擇的人的DNA的相差在1000個堿基左右1; 換句話說,我們是99.9%相同。正是這种相似性,使得适用于所有美国的“参考”人类基因组测序。我们的DNA的一定区域包含比其他的差异,和短串聯重複序列是DNA的一个区域呈现个体之间的大变化的一个例子。

DNA指紋取决于短串聯重複序列(STR),两个或更多个核苷酸的短的重复模式(例如(的分析CAñ或(ACGTñ,其中Ñ是幾百)。例如,序列CGTCAG在CAC,所述二核苷酸的CA重複13次(Ñ = 13)。

数千种不同的短串聯重複序列,或几十已在人類基因組中已經確定。可疑交易是在人口中的不同成員在染色體上的相同位置(基因座)觀察到的,但重複的次數(Ñ個體之間)變化。在重复次数這种变化的一个例子多態性

STR分析

STR分析使用PCR技術來測量在特定基因座的重複次數。引物結合于特定STR基因座的DNA和,通過PCR延伸。PCR産物的長度取決于重複的次數。如果PCR引物被標記,PCR産物將被標記,從而在反應結束時檢測出的産物。對于每個基因座,將有兩個PCR産物(每個兩個等位基因)。

多個不同的STR基因座的同時分析使個人的特有配置文件被建立起來。幾個PCR反應在不同的STR基因座單管同時進行,得到幾種欧美japanese(兩個用于每個基因座)。以下組件是必需的:

  • DNA樣本,例如從犯罪現場一個人的頭發,或從犯罪嫌疑人的嘴湊口腔細胞
  • 兩種寡核苷酸PCR引物:標記在5'端用一個引物32 P,和一種未標記的反向引物
  • 熱穩定DNA聚合酶
  • 四脫氧核苷三磷酸:的dATP,dGTP,的dCTP,dTTP的。

當標記的PCR産物在聚丙烯酰胺凝膠上運行,它們根據大小分離。結果是一個“DNA梯子”,即一個單獨的(的特性圖9)。

DNA指紋通过STR分析

圖9 | DNA指紋图谱通过STR分析短串聯重複序列(STR),二,三或重复几次,四核苷酸单位在每个人的基因组中存在。當通過PCR使用標記的引物擴增中,産生不同長度的標記的DNA片段。這些片段通过凝胶电泳或毛细管电泳分离,得到的个体的独特的DNA“条形码”。

使用多個位點提供了一個非常高度的確定性,在人口不兩個個體將具有相同的輪廓(除非它們是同卵雙胞胎)。一些當前法醫系統使用10(如英國)或13(例如,美國)的STR基因座。含有PCR引物的標准STR基因座的試劑盒在市場上銷售。

熒光STR分析

在STR分析的更現代的變型中,PCR引物標記有熒光染料。對于不同的STR基因座的引物標記有不同的熒光染料,增加第二維度的測定(圖10)由于其迄今可能開發只具有良好分辨的光譜特性,三種不同的熒光染料的熒光染料的數量有限通常使用。

熒光STR分析

圖10 | 熒光STR分析在熒光STR分析,PCR引物是荧光标记的,這导致荧光标记的PCR产物。利用不同的熒光標記的是指从不同的STR基因座始发的欧美japanese和频带可以更容易辨别。

親子鑒定

在亲子纠纷STR分析

圖11 | 在親子STR分析爭議的親子糾紛(使用3個STR位點)使用STR(短串聯重複)分析的一個簡單的例子。在STR波段的一半來自母親,一半來自父親。某些頻段是從母親和父親都繼承。如果孩子的DNA圖譜包含所有存在既不是母親,也不是所謂的父親的DNA圖譜帶,那麽所謂的父親不是孩子的親生父親。如果在這个例子中涉嫌的父亲被指示支付子女抚养费?

單核苷酸多態性(SNP)

突變發生在DNA爲在錯誤的結果,DNA的複制和化學損壞。這些突變具有潜在危害的生物体,和一组DNA修複機制存在扭轉他們。多態性是在一個DNA序列被建立並在人口穩定的,並且不有害的變化。有兩個或更多個同樣可接受的替代品,其中一個恰好是比其他人更常見。在一般情况下,如果一个变化已在人口的1%或更多的频率,它是一个多态而非突變。

单核苷酸多態性(SNPs,显剪刀)是多態性在人类基因组中最常见的类型。之一的兩個特定堿基(等位基因)將發生在一個SNP位點; 例如,A將發生在人口的一些成員,而在其他-G。单核苷酸多態性发生每1000个碱基对约一次,构成本体的3×10的6在基因組中的變化,並傾向于在人口保持穩定。单核苷酸多態性发生在基因以及在控制基因表达的基因组的周围区域。

一个特定的SNP的一个等位基因上的基因的作用可能并不大 - 也许影响在一个微妙的方式所编码的蛋白质的活性 - 但即使微妙的影响可以影响易感性常见的疾病,如冠状动脉血栓形成或阿尔茨海默氏病。通過在疾病的已知患者研究大量的SNP能夠確定疾病是否有遺傳鏈路。在這种情况下,个人数字越大研究,遗传链路出现的可能性越大。一旦這样的链接被发现,在人口感染该病的任何个体的易感性可以预测的。SNP分析可能發揮在醫藥和診斷對未來的影響力越來越大的作用; 例如,在預測個體對藥物的反應,使相應的處理,可以規定(藥理學)。

在許多個SNP的兩個等位基因有關于在人群中的頻率相同,即如果可以發生在一特定基因座的兩個堿基是A和G,一半人口將具有腺嘌呤,而另一半將具有鳥嘌呤。显然还没有进化压力有利于在這些基因座的等位基因的一个或另一个。這些种类的SNP的是在遗传分析非常有用的。相反,如果發生在一個非常低的水平的等位基因,所述SNP是作爲分析工具有用要少得多,因爲它會被很少遇到。因此,在DNA已经从大量个体(例如,从一组人患心脏疾病)的合并,這将是很难检测的次要等位基因的存在,即使是這一组中超过限额相对于未患有疾病的一组。

单核苷酸多態性的分析还可以提供关于物理特征的信息。這方面的一个例子是眼睛的顔色先试商用(Retinome™)。除了眼睛的顔色,单核苷酸多態性已与人类表型的其他功能,如头发和皮肤的顔色联系起来。大量的表型的SNP分析,相當于建造一個單獨的“並圖”的畫面,因此是一個功能強大的伴奏STR分析法醫調查員。在分析的SNP的挑战是等同于分析为单点突變的DNA,如基因多態性和基因突變的现象有关。

DNA診斷和突變檢測

DNA診斷涉及與特定疾病相關的基因組或線粒體DNA的區域的鑒定和分析。通常該DNA序列將負責一個有缺陷的蛋白質的表達,但它也可以是控制基因表達的區域。当這种DNA序列已被确定,它的个体的DNA样品中存在(或不存在)必须确定。的突變DNA筛查取决于的灵敏,快速,准确和经济程序的发展,其中PCR扩增结合使用与适当的探针技术(實時PCR)。

基于DNA的探针的技术,可用于检测小至单个核苷酸取代,插入和缺失突變的差异。這样的点突變可以引起的遺傳性疾病,如鐮狀細胞性貧血,囊性纖維化,苯丙酮尿症和亨廷頓氏病。遺傳分析是很重要的預先和産後診斷,遺傳信息也可以被用于個人的易感性預測外源性風險,如飲食或環境因素。傳染病如麻疹,風疹,艾滋病毒,甲型和乙型肝炎,和由病原生物體如疾病沙門氏菌念珠菌,可以使用DNA探針技術進行診斷。某些寡核苷酸基于探針的技術是足夠的選擇性密切相關的有機體/病毒區分,如1型和單純疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)的2變體。

實時熒光定量PCR

實時PCR是对结合的DNA的正常PCR扩增与PCR产物的同时检测,通常是在一个反应??管中的PCR主题的变化。在PCR中,雙鏈DNA的量與每個循環增加。的PCR的多次循環後,存在的DNA的量的大量增加。在實時PCR(也称为定量PCR,或定量PCR),结合于双链DNA被加入到PCR反应的试剂。作爲雙鏈DNA産生,所述試劑結合到新合成的DNA,並産生使反應實時監視的信號。同时PCR的目的是DNA的扩增,實時PCR的目的是DNA样品或反应的分析。

荧光實時PCR是PCR扩增和荧光检测的组合。在其最简单的形式中,荧光實時PCR包括使用的有机染料,只有当结合到DNA双链体是荧光的。当這样的染料是在PCR反应开始时加入发生荧光的增加作为DNA的数目双链增加,并且這是指示成功的PCR。的SYBR Green(圖12)是結合雙鏈DNA,並成爲對結合(雙鏈DNA染料配合物是熒光)的熒光的分子的一個例子。

的SYBR Green

圖12 | 的SYBR Green 的SYBR Green I,结合于双链DNA的荧光分子的结构。

的SYBR绿實時PCR方法具有严重的局限性,因为它是无特异性,即无论是获得的PCR产物的性质的阳性结果。作爲PCR是容易發生僞影,例如引物二聚體的形成,使用非選擇性染料簡單擴增並不總是非常豐富,並基于探測的方法提供更有意義的結果。

基于探针實時熒光定量PCR

當在人的診斷使用PCR它是某些欧美japanese的確切性質是重要的。在PCR产物(擴增子)键序列的鉴定可以通过加入荧光DNA探针来实现(一个短的合成寡核苷酸,其是在PCR擴增子的特定序列互补,并且不发出荧光,除非它结合到擴增子)在PCR反应。几种不同类型的探头满足這些标准,這些将在下面详细讨论。

当DNA探针在實時PCR中使用,只有在PCR擴增子中包含的互补的序列的荧光探针获得肯定信号:荧光信号是序列特异性的。例如,临床样品可以为导致囊性纤维化基因被测试如下:a探针是囊性纤维化基因(目标)的突變区域互补合成和PCR是在此存在对样品进行探测。在PCR扩增过程中的DNA分子(PCR擴增子)的数量增加而增加。如果突變存在时,探针 - 靶杂交体的浓度也增加,荧光信号生长在可预测的方式,表明突變的基因确实存在。但是,如果不产生荧光信号,這表明该患者不携带特定突變。在实际的临床应用两个突變体和野生型探针并行使用。患這种病的人,将给予从突變探头一个积极的信号,而未受影响的人将给予从野生型探针一个积极的信号。本病的攜帶者可能給來自兩個探頭一個積極的信號。

专门的设备是必要的荧光實時PCR和许多文书已设计用于此目的。它們都包括一個熱循環儀來驅動PCR反應中,一個光源,以激發熒光染料(s)和一個熒光檢測器,用電腦來控制儀器和處理數據一起。

在一般的“熒光”探針含有熒光染料和淬滅熒光。它們是在不存在靶核酸的非熒光因爲猝滅劑從激發熒光團吸收的能量,並且該能量在較高波長作爲熱量耗散或輻射。還有的熒光淬滅兩個獨立的機制:碰撞淬火FRET淬火

該TaqMan方法

所述的TaqMan测定法是用于PCR产物的分析使用最广泛的实时的方法,并在SNP分析和突變检测广泛使用。TaqMan探針是由在一端用熒光團標記的寡核苷酸,例如5'-FAM(5'-熒光素),並在另一淬滅劑的熒光,例如3'-TAMRA的。在495處其吸收波長熒光的激發通常會導致熒光發射在525nm。然而,這落在TAMRA染料是在TaqMan探针接近的宽吸收光谱范围内,所以能由TAMRA染料由于熒光共振能量轉移(FRET)被吸收和荧光在TAMRA的发光波长观察(585纳米),而不是在FAM的发射频率。

所述的TaqMan方法描述圖13,在每一个冷却循环之前,伸展相,TaqMan探针杂交的PCR擴增子的互补序列。當Taq聚合酶聚合過程中遇到該TaqMan探針,酶的5'至3'外切酶活性將導致探針的消化。這在495纳米分离受体(TAMRA)和激发荧光体(FAM),现在带领由FAM在525纳米至荧光发射。从FAM没有能量传递给TAMRA现在可以发生,因为這两种荧光染料相距甚远。因此,當TaqMan探針已被消化的TAMRA染料不發熒光。总体而言,在525nm处的增加的荧光发射,并在585下降(nm)是指示阳性PCR反应,并且重要的是证实了正确的擴增子的存在。其他熒光染料可以在TaqMan探針可以使用,只要它們具有合適的熒光發射和吸收光譜。

該TaqMan方法

圖13 | 的TaqMan分析

熒光共振能量轉移(FRET)

所述的TaqMan测定法利用熒光共振能量轉移(FRET),已被广泛用作光谱“尺子”,以检查的DNA二级结构的有力工具。在FRET中,激發的熒光團(能量供體)其能量通過誘導偶極-偶極相互作用時的偶極子是在大致平行的方向傳送到相鄰的發色團或熒光團(受體)非輻射。對于發生FRET必須有供體的發射光譜和受體的吸收光譜之間的重疊。供体和受体之间的能量转移的效率是成反比的两种荧光团(1 /之间的距离的第六功率6)。的最佳距離(?爲能量的非輻射轉移)爲10-100埃之間爲最常用的熒光團。

熒光猝滅機制

圖14 | 熒光猝滅機制

見一節FRET淬滅劑的信息,具体的FRET淬滅劑,如BHQs。

分子信標

分子信標是一个化学修饰的寡核苷酸,采用在不存在互补靶序列的茎-环结构。该环路由一个旨在杂交PCR过程中擴增子的特定序列的探针,和杆构成的两个短的互补寡核苷酸,其中一个标用荧光团和其他与非荧光猝灭剂。在莖-環的形式中,熒光團和猝滅劑在非常靠近由短雙鏈體結構保持,並且,如果所述熒光團被激發,能量被猝滅劑吸收,並且作爲熱量耗散(非輻射能量轉移)。這是在分子信標(的“封闭”或“暗”状态。圖15,上圖)。

在PCR中的每个循环,在变性步骤中,打开的分子信標的茎环(即在干游离的碱基对或“融化”)。在随后的冷却(退火)阶段,分子信標的环路杂交在擴增子的互补序列,从而形成一个短双链体。在這种形式(“开放”的形式)的茎离得太远,联想,荧光团和淬灭剂保持分开,并且照射产生的荧光信号(圖15,下圖)。在實時PCR,荧光必须在在该信标中的茎环形式是稳定的(通常约50℃)的温度下进行测量,以使未杂交探针不产生不希望的背景荧光。

分子信標

圖15 | 分子信標

最初,分子信標被设计用在5'末端的荧光团5-(2'-氨基乙基) -氨基萘-1-磺酸(EDANS)和荧光猝灭剂的4-(4'- dimethylaminophenylazo)苯甲酸(DABCYL)在3'末端(圖16)。

DABCYL和EDANS

圖16 | DABCYL和EDANS 熒光淬滅DABCYL和熒光EDANS的結構。

最近,更廣泛的熒光團已用相同DABCYL猝滅一起使用。碰撞熒光淬滅是在封閉的形式非常有效的,並且不上淬滅劑的吸收光譜強烈依賴。然而,熒光的開放形式的水平是有限的熒光團和猝滅劑保持相對彼此接近。

分子信標可以用来通过测量荧光的强度在每个PCR循環(定量PCR)退火阶段量化擴增子的PCR过程中的浓度。他们也已经在SNP和突變分析广泛使用。几个分子信標,每一个独特的荧光团,可以在多重PCR反应中用于同时分析在不同基因座的单核苷酸多態性。

蠍子引物

蝎子是PCR引物附着(通过接头)一个分子信標充当PCR塞子。這个连接体,通常六乙二醇,隔离底漆的信标部分。蝎子的引物部分的PCR延伸后,将所得的擴增子中包含的序列是探针部分互补。在PCR循環的变性阶段擴增子呈现单链和冷却所述探针元件结合到這种补体,以形成分子内双链体。在這种形式的猝灭剂不再位于接近荧光团和荧光信号产生(圖17)。

圖17 | 蠍子引物

蠍子探針含有在單個寡核苷酸幾種化學修飾,因此是相對複雜的分子來合成。然而,它们具有比分子信標一些主要的优点。PCR过程中的活性蝎的形成是一个分子内的过程,因此,比使用分子信標发生等效的分子间反应快得多。此外,蝎子的活性形式是比分子信標,這往往脱落他们的目标,并折叠成非荧光分子内发夹环的动力学更加稳定。在对比TaqMan探针,蝎子不取决于酶裂解以产生荧光信号,和高速PCR循環因此可能的,从而导致非常快速而可靠的检测系统。

其它診斷方法

DNA微陣列

寡核苷酸可以化學附著到材料如玻璃或矽的表面,在其上它們形成小的大約100微米的“點”(10 -4直徑米)。寡核苷酸的大量可在單個幻燈片中加以規定,以形成微陣列,和熒光標記的DNA(標記的PCR産物或cDNA)的單鏈可通過雜交捕獲。(基因是單鏈DNA,以從它是由合成的RNA互補的反轉錄,它給出了在細胞(表達分析表達的各種RNA消息)的性質間接信息)。如果這样的微阵列包含1000点则在理论上是可能的杂交一个唯一的互补核酸序列的每个点。的DNA序列的同一性,從光點的位置與它雜交使用熒光掃描儀推斷。

附連到捕獲的核酸鏈的熒光標記物可以用許多不同的方法加入。PCR産物可以在5'末端簡單地通過使用含有5'-熒光染料PCR引物進行標記。PCR引物可以与多个荧光团进行标记,但是這些往往以猝灭彼此并且还抑制了PCR反应。一种更好的方式来介紹多个标签到PCR产物是在PCR使用荧光标记的脱氧核苷三磷酸或逆转录酶反应(例如熒光素標記的dT)。然而,在PCR反應的效率可以通過該雜環基,其可以抑制Taq聚合酶上的化學修飾受到損害。一个精心确定未标记和标记的脱氧核苷三磷酸的混合物,因此必须使用,并且這是罕见实现标记的密度大于每30个核苷酸1荧光更大。微陣列測定,也可以由個別的PCR産物附著到滑動作爲離散斑點,並與熒光標記的寡核苷酸(池探測在反向格式進行圖18)。

DNA微陣列

圖18 | DNA芯片

因为DNA链的非常大的数字,可连接到单个阵列DNA微陣列是高通量突變,SNP和基因表达分析是有用的。微陣列是由適合機器人系統自動化,允許非常高的吞吐量。然而,他們目前由于對表面分子的一些不良化學和生物物理特性的挑戰。首先,它難以形成非常密集陣列。100μm的點尺寸是可以實現的,但較小的斑點(例如1微米)將允許每個陣列的斑點的高得多的號碼,允許使用溶液相DNA和更大的吞吐量的較小體積的。其次,互補DNA分子的一個表面上的雜交是幾乎沒有溶液雜交效率高。爲了使系統可行,表面的性質和表面和附著的DNA之間的連接體的性質,必須仔細控制。

熒光原位雜交(FISH)

原位雜交(ISH),其允許特定的DNA序列的使用放射性標記染色體的識別和可視化,在討論的合成和化學修飾的寡核苷酸的應用熒光原位雜交(FISH),其中通过采用基于荧光的检测和可视化通过荧光显微镜延伸ISH,是在遗传分析的重要工具。FISH的原理在于標記探針的退火以固定的細胞或組織的染色體內的互補鏈,隨後通過檢測熒光標記的。探針(DNA或RNA)通常由三個聚合酶基于酶的方法中的一種(切口平移,隨機引物或PCR),其允許熒光標記的脫氧核苷三磷酸的摻入制備。每30個核苷酸一種熒光標記的平均摻入水平是典型的。的DNA探针的长度可以是100 bp和1000bp的间。較長的探針增加的非特異性背景熒光,但短探針是很困難的,由于雜交不足和標簽低水平來檢測。重要的是目標爲在探頭訪問,必須在原位,而不是由核酸酶降解被保留。可视化限制从整个染色体为40 kb的染色体区段跨越。

荧光原位杂交已经用于识别染色体内的基因的位置(虽然這是与人类基因组的测序不太有用),染色体“画”,用于可视化整个染色体的技术,并在表征和诊断疾病。


香港基因檢測中心

HK.DNA DIAGNOSTICS CENTRE LIMITED

Call Us: 00852-55129372 For Emergency